采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化

運用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學(xué)觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發(fā)生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態(tài)變化（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時間點的爆發(fā)性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血氣結(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。

5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細胞內(nèi)可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，線粒體豐富（圖10D）；神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹(圖10E)；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變（圖10F）。

對照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達（圖11B）。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴張，細胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少（圖11C）。小膠質(zhì)細胞包圍吞噬神經(jīng)元細胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖11D）。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內(nèi)可見呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質(zhì)細密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細胞器豐富（圖12B）；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風(fēng)險的病原，人類感染風(fēng)險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學(xué)實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

1. 動物癥狀觀察

動物自感染后第3天開始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為體重增長變緩、弓背豎毛、后肢行動遲緩至癱瘓、死亡等癥狀（圖1）。感染后第4天時，動物全部表現(xiàn)出后肢癱瘓、停止進食等癥狀，感染后第5天動物開始出現(xiàn)死亡，在10天內(nèi)全部死亡。

2. 組織內(nèi)病毒復(fù)制情況

感染后最初在外周血中檢測到CA16病毒，隨后，血液中病毒載量逐漸下降。各組織中病毒載量在第3天和第5天達到高峰，其中骨骼肌內(nèi)病毒載量最高，在第3天可達到108 copies/mg組織，腦中病毒載量在第5天達到高峰，可達106 copies/mg組織，表明了病毒感染引發(fā)病毒血癥后，病毒經(jīng)血液向組織擴散，并在組織內(nèi)復(fù)制。腦內(nèi)病毒的高峰期滯后于骨骼肌，表明病毒經(jīng)肌肉內(nèi)神經(jīng)元逆向軸突傳遞至腦內(nèi)，而非病毒經(jīng)血液直接擴散至腦部（圖2）。

此外，在心臟、肝臟、肺、腎臟和脾中均可檢測到病毒核酸。

3. 病理改變

感染第5天時，處死動物，觀察各組織的病理改變。小鼠的肺、腎和脊髓內(nèi)未見與病毒感染有關(guān)的病變。心臟內(nèi)表現(xiàn)為局灶性心肌纖維變性壞死，少量炎細胞浸潤；肝內(nèi)局部肝細胞發(fā)生輕度空泡變性，可見肝實質(zhì)中發(fā)生輕度的髓外造血；脾臟髓外造血增多；骨骼肌的肌纖維腫脹、壞死斷裂、肌纖維之間可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，也可見巨噬細胞等炎性細胞、壞死性肌炎；腦內(nèi)未見與病毒感染有關(guān)病變，發(fā)現(xiàn)輕度血管源性水腫，可能與缺血缺氧有關(guān)；部分腸上皮細胞出現(xiàn)空泡變性。

SPF級1-10日齡乳鼠，ICR、C57或Balb/c均可。

1. 病毒準備

CA16在人橫紋肌瘤細胞（RD）中培養(yǎng)、繁殖，采用凍融法釋放病毒，超速離心法富集病毒。毒株為shzh05-1，2008年分離自深圳市，GenBank存儲號為EU262658。

2. 實驗動物

可使用SPF級別的1-10日齡乳鼠，品系包括ICR、C57BL6J、Balb/c，母鼠自然哺乳，在動物生物安全二級實驗室內(nèi)獨立飼養(yǎng)。

3. 病毒感染

根據(jù)預(yù)實驗確定感染劑量，10日齡乳鼠經(jīng)輕度麻醉后，經(jīng)腹腔注射2.5×107 TCID50 的CA16 shzh05-1,攻毒體積為100微升/只，空白對照組注射等量RD細胞上清。

4. 模型分析指標

（1） 癥狀觀察

感染后動物觀察14天，記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據(jù)癥狀嚴重程度，參照以下標準對動物進行打分：

0，未見異常；1，豎毛；2，后肢遲緩無力；3.單后肢癱瘓；4，雙后肢癱瘓；5，死亡。

（2） 病毒檢測

分別在感染后第1天、3天、5天和7天處死動物，分離主要組織器官，提取RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測組織內(nèi)病毒載量，記錄病毒復(fù)制情況。PCR引物序列為：CA16-F1: GAAAAACCCTCGACACACTAG；CA16-R1: ATCAGCGTCCTTGCAATACTCG (1095)

（3） 病理診斷

分別在感染后第3天、5天處死動物，分離主要組織器官，HE染色觀察病理改變。

手足口病是由腸道病毒引起的，以發(fā)熱和手、足、手足口病是流行于亞太地區(qū)的嬰幼兒常見傳染病。柯薩奇病毒A16型（CA16）和人腸道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原體之一，引發(fā)嬰幼兒手足口病及皰疹性咽峽炎，嚴重并發(fā)癥包括無菌性腦膜炎，而神經(jīng)源性的肺水腫或肺出血是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的原因之一。該病毒近年來在大陸地區(qū)的感染，已經(jīng)造成了數(shù)十萬兒童感染，并不時伴隨有死亡病例，目前尚無臨床可以使用的疫苗和治療藥物。

CA16屬于微小RNA病毒科，腸道病毒屬。CA16感染主要引起自限性的手足口病，偶爾引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心功能衰竭等，嚴重者可導(dǎo)致死亡。

CA16主要通過糞口傳播，病毒最初定植于鼻咽部或胃腸道粘膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，進而引起第一次病毒血癥。若機體免疫力差，病毒可擴散至全身組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，最終侵犯靶器官，如腦、腦膜、脊髓、心肌和橫紋肌以及皮膚黏膜組織，引起重癥病變。尸檢時主要病變?yōu)樯窠?jīng)元壞死等。