GD小鼠是由8個近交系小鼠，通過3代協同重組雜交，再經20代近交傳代，獲得的重組近交系。相比8個原始親本，GD小鼠擁有豐富的遺傳型和表型，可用于多基因連鎖分析和新的疾病模型鑒定。

本模型不涉及除遺傳物質重組對環境生態影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會的要求執行，可以確保不產生安全性問題。

1、 基因鑒定信息

圖1 Lgr5,Rosa26tdTomato基因凝膠電泳鑒定結果

2、組織化學染色結果

圖2 潘氏細胞免疫組織化學染色結果

圖3 杯狀細胞染色結果

3、譜系追蹤系統的建立

在顯微鏡下觀察誘導后不同時間點小腸干細胞的變化，發現誘導后3d隱窩底部已經開始出現熒光，并有向上移動的趨勢； 誘導后5d熒光細胞已經移動到隱窩的快速增殖細胞(TA)部； 誘導后7d可看到有少量從隱窩分裂分化的細胞已經移動到絨毛頂端；誘導后14d有更多的熒光細胞到達小腸絨毛頂端，少量絨毛從隱窩基底到絨毛頂尖則全部帶有熒光；誘導后45d可見整個小腸絨毛中熒光細胞更多、 更密實。 提示分化的細胞系來源于Lgr5 +干細胞， 小鼠小腸干細胞譜系追蹤模型成功建立。

實驗動物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

試劑：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機，leica DMI8活細胞項目合作單位

實驗操作規程：將Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系與Stat5 或 icS5 floxed小鼠雜交，分別為對照組（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；實驗1組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；實驗2組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周齡時，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(擴增目的片段長174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCAGTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3'。PCR條件：預變性94℃3min；94℃變性30s，66℃復性1min，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸5min。選取雙陽性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。實驗組小鼠按100mg/kg體重腹腔注射他莫昔芬，對照組小鼠注射等量的玉米油。通過 Tam 誘導， 然后分別在 12?小時和 1, 3,5, 7, 30， 122和280天麻醉處死各組小鼠。分別取結腸、空腸、回腸組織，用冷PBS沖洗腸道組織，縱向剖開，放入多聚甲醛中固定過夜，制作冰凍切片在子代腸上皮細胞中追蹤檢測是否去除 Stat5 或活化 STAT5能夠改變腸上皮中的tdToamto 信號強度和位置.

譜系示蹤技術是一種利用Cre-loxP 位點特異性重組系統對干細胞細胞子代分化命運進行追蹤展示的方法，用于揭示特定類型干細胞在組織發育、疾病和再生中自我更新、分化和轉分化的現象。譜系示蹤系統可以追蹤來源于同一干細胞的所有子代細胞，是在成體哺乳類組織中研究干細胞特性的一種重要工具，通常使用Cre-LoxP系統，需要兩種品系小鼠：一種是具有組織或細胞特異性的Cre重組酶小鼠，另一種是帶有loxP-STOP-loxP（錨定STOP）序列的報告基因小鼠。通過他莫西芬誘導可在兩種品系雜交后的雙陽性子代小鼠特定細胞內表達Cre重組酶，以此剪切STOP序列，從而使報告基因得以表達，獲得遺傳基因改變的細胞，進而達到示蹤的目的. 具體來講：在含有CreER的轉基因小鼠中，CreER由于在特定的啟動子驅動下，表達在特定的細胞類群中，當CreER 小鼠與Rosa26（Rs）ER位點含有loxP 的報告基因（floxed基因）小鼠交配時，CreER 通過識別loxP 位點之間的終止序列切除，從而使含有RsCreER 的細胞類群表達出報告基因。由于這種切除使DNA水平上的，所以是永久不可逆的，因此，利用該細胞示蹤蹤技術可以解析特定細胞的起源和命運。 研究背景 細胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信號轉導和轉錄活化因子（STAT） 5 是幾乎所有腸道細胞因子，生長因子和生長激素下游轉錄活化因子 。去除或減少 STAT5 能夠導致胚胎干細胞，造血干細胞，肝干細胞，髓樣干細胞，以及乳腺干細胞分化異常和組織功能障礙 。 我們實驗室報道了敲除腸上皮 STAT5 導致 Lgr5+ IESC 再生障礙，上皮屏障缺失，增加腸炎易感性 。相反， 短暫的 STAT5 酪氨酸磷酸化（pYSTAT5） 能夠增加Lgr5+腸干細胞再生，保護腸道，減輕實驗性腸炎。 但是， STAT5 是否能夠調節 IESC 內源性的轉錄、激活因子，調節何種上游細胞因子以及誘導何種腸上皮分化，還未見報道。因此我們使用特定的 Stat5 復合基因工程小鼠與Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，進行腸上皮細胞分化的譜系追蹤來確定持續性的 pYSTAT5 激活能夠誘導腸道干細胞分化為何種細胞類型。