動(dòng)物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個(gè)月后死亡。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1. 小鼠鑒定結(jié)果解讀

圖1.鑒定結(jié)果圖。27#，30#，19# KO- PCR 反應(yīng)可以獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應(yīng)可以獲得422bp 條帶，為雜合子。16# KO- PCR 反應(yīng)未獲得~559bp條帶； WT- PCR 反應(yīng)可以獲得422bp 條帶，為野生型。注：數(shù)字為鼠尾號，WT為C57BL/6J野生鼠，N為Negative空白對照，M為DNA Marker。2. Cilp2在衰老后表達(dá)水平下降 與年輕組相比，男性與女性老年人血漿中Cilp2蛋白水平有顯著降低的趨勢，表明Cilp2在衰老過程可能發(fā)揮了作用（圖2）。

圖2：血漿中年輕人和老年人血漿中的Cilp2蛋白質(zhì)水平。3. Cilp2過表達(dá)會改善衰老性心肌肥厚 通過構(gòu)建Cilp2重組腺相關(guān)病毒，尾靜脈注射至衰老小鼠構(gòu)建Cilp2過表達(dá)組。我們發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠的體重與心重與年輕組明顯增加，而Cilp2過表達(dá)組與衰老組相比，心臟重量及心臟重量與脛骨長比值顯著降低(圖3A)。此外，通過小動(dòng)物超聲機(jī)檢測各組小鼠的新功能，我們發(fā)現(xiàn)左心室舒張末期直徑(LVSd), 左室后壁厚度(LVPWd)在衰老組顯著增高，表明在衰老后心功能下降；而過表達(dá)Cilp2后發(fā)現(xiàn)，LVPWd雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有下降的趨勢，表明Cilp2可以部分減緩衰老過程中的心功能下降(圖3B)。

圖3.Cilp2對衰老心臟功能的影響。（A）體重、心臟重量和心臟重量/肱骨長的差異比較。（B）超聲檢測三組小鼠的LVSD和LVPWd的差異。4. Cilp2對病理性心肌肥厚的影響 通過qRT-PCR檢測心肌肥厚分子標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，與年輕心臟的Cilp2 mRNA水平相比，衰老心臟的Cilp2 mRNA水平呈下降趨勢,過表達(dá)組Cilp2 mRNA 顯著增高（圖3）。與病理性的心肌肥厚不同，衰老后的心臟Anp、Bnp無顯著升高；而Mhy6 mRNA 水平下降，Mhy7 mRNA水平升高與病理性心肌肥厚一致。Cilp2過表達(dá)組有逆轉(zhuǎn)Mhy6的趨勢（圖3）。

圖3 通過qRT-PCR檢測Cilp2、Anp、Bnp、Myh6和Mh7的mRNA水平。

1. 項(xiàng)目策略圖 此模型采用CRISPR/Cas9技術(shù)對Crtc1基因進(jìn)行基因編輯，原理示意圖如下：

2. 項(xiàng)目策略概述 利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。3. gRNA序列信息gRNA1: GCTGTTCAGGATGGGCCAAT (5’ – 3’), PAM: GGG.gRNA2: ACAAGCAGAGCAGGTGGGCG (5’ – 3’), PAM: GGG.4. 建立主動(dòng)脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手術(shù)），通過超聲心動(dòng)圖評價(jià)心臟功能，小鼠采用異氟脘吸入麻醉，將小鼠左胸前區(qū)剃毛，涂抹耦合劑，取仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀（VET V6，VINNO，中國），頻率為12.5 MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測量各項(xiàng)指標(biāo)。5．小鼠心臟組織切片形態(tài)及病理檢測 稱取小鼠體重，小鼠經(jīng)心臟灌注，取出心臟后用濾紙吸干血液后稱重，計(jì)算心臟重量與體重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。6．心肌肥厚分子標(biāo)志物檢測將各實(shí)驗(yàn)組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應(yīng)用qPCR檢測心肌肥厚指標(biāo)Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 健康、衰老和壽命是人們最關(guān)心的問題，自古以來人們也一直在探索其中的奧秘。隨著我國進(jìn)入老齡化社會，年齡增長帶來的疾病嚴(yán)重威脅人類的健康，但是目前對于衰老的認(rèn)識還處于初步階段。衰老引起的左心室纖維化、僵硬和室壁增厚，均會引起心肌舒張功能障礙，導(dǎo)致心力衰竭。在衰老的心臟中，心肌細(xì)胞的數(shù)量可能會隨著年齡的增長而減少，但心臟成纖維細(xì)胞會明顯增殖，它可以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白。心肌成纖維細(xì)胞增殖過多時(shí)，會出現(xiàn)膠原的合成與降解失衡，膠原比例失衡、細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，這是諸多心血管疾病發(fā)展到一定階段共同的病理變化。 目前，心臟衰老及其導(dǎo)致的心肌肥厚的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，臨床上缺乏有效的藥物治療手段。因此，探索心臟衰老和衰老性心肌肥厚病理發(fā)生的分子機(jī)制有助于尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，改進(jìn)抗心臟衰老和衰老性心肌肥厚的治療方案，并推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療在心臟衰老防治領(lǐng)域的發(fā)展。二、模型背景1、Cilp2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：68709? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/68709? 敲除基因名稱（MGI號）：Cilp2（MGI: 1915959）? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：? http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000044006;r=8:69880369-69887687;t=ENSMUST00000057831? 方案針對的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000057831.7? 方案敲除的exon：exon 4~62、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對結(jié)核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。 主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 衰老，系指隨著時(shí)間的增加，生命體功能衰退的過程[1]。壽命長用做低等模式生物評價(jià)衰老最重要的指標(biāo)；而在高等動(dòng)物中，細(xì)胞、組織與器官結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，單純用壽命作為衰老的唯一指標(biāo)并無全面，有研究認(rèn)為，改善衰老相關(guān)疾病被認(rèn)為是減輕衰老的表現(xiàn)[2, 3]。衰老相關(guān)的系統(tǒng)性疾病包括：心腦血管疾病、腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病與神經(jīng)退行性疾病；相關(guān)研究也通常會記錄衰老相關(guān)疾病的狀態(tài)來評價(jià)個(gè)體衰老的情況[4]。宏觀的生命體系統(tǒng)特征往微觀的細(xì)胞與分子活動(dòng)的表現(xiàn)形式，若透過衰老的生物學(xué)特征尋找到衰老的細(xì)胞、分子調(diào)控機(jī)制對于延緩衰老至關(guān)重要。經(jīng)典的細(xì)胞衰老是指一種不可逆的細(xì)胞周期阻滯機(jī)制，相關(guān)因素包括：端粒縮短，DNA損傷，活性氧累積，原癌基因與抑癌基因異常活動(dòng)，代謝改變，未折疊蛋白反應(yīng)，炎性因子長期刺激，有絲分裂異常造成的應(yīng)激壓力等[5]。 目前，衰老研究領(lǐng)域也大致分為應(yīng)激適應(yīng)、表觀遺傳、炎癥、生物大分子損傷、新陳代謝、蛋白穩(wěn)態(tài)、干細(xì)胞與再生七大類[6]。此外，被深入研究過的分子包括p53、p21、p14ARF、p19ARF和p16INK4A因其在衰老過程中發(fā)揮了重要作用，已被普遍用作鑒定衰老的標(biāo)志物[7]。 軟骨中間層蛋白（cartilage intermediate layer protein，Cilp）主要分布在軟骨細(xì)胞中，多個(gè)組織中均能表達(dá)，其中心臟、中樞系統(tǒng)、骨骼肌表達(dá)水平較高。目前，關(guān)于CILP的研究較少，其中主要涉及骨關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突觸，研究發(fā)現(xiàn)Cilp1與Cilp2與衰老相關(guān)疾病骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)，Cilp1對骨關(guān)節(jié)炎有損害而CiLp2對其卻有保護(hù)作用[8, 9]。此外，另有研究報(bào)道[10-12]Cilp1在缺血-再灌注損傷模型中，Cilp1在脈及左心室中的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著升高，Cilp1可通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路來抑制成纖維細(xì)胞的活化。與Cilp1類似，Cilp2一部分研究主要集中在Cilp2及其單核苷酸基因多態(tài)性位點(diǎn)與在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系；有研究[13]確定了Cilp-2和Pepck存在直接相互作用，并認(rèn)為Cilp-2在調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖產(chǎn)生中起著重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，Cilp2基因的小t等位基因多態(tài)性對血脂和脂蛋白水平的升高有保護(hù)作用[14]。 本研究通過前期質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cilp2在老年人血漿中的蛋白水平顯著降低；此外，通過對衰老小鼠注射Cilp2病毒，發(fā)現(xiàn)Cilp2能改善小鼠的心功能。而目前尚未報(bào)道Cilp2在衰老心臟過程中的作用，因此本項(xiàng)目擬探究Cilp2對心臟衰老的影響及探究其潛在的分子機(jī)制。參考文獻(xiàn)：1. Lopez-Otin, C., et al., The hallmarks of aging. Cell, 2013. 153(6): p. 1194-217.2. Kaeberlein, M., M. McVey, and L. Guarente, The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev, 1999. 13(19): p. 2570-80.3. Rogina, B. and S.L. Helfand, Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(45): p. 15998-6003.4. Childs, B.G., et al., Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(10): p. 718-735.5. van Deursen, J.M., The role of senescent cells in ageing. Nature, 2014. 509(7501): p. 439-46.6. Kennedy, B.K., et al., Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell, 2014. 159(4): p. 709-13.7. Sharpless, N.E. and C.J. Sherr, Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer, 2015. 15(7): p. 397-408.8. 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