為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經預測它們的蛋白結構相對于野生型斑馬魚出現移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發現在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導致了mRNA的全面降解所導致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發現npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發現SB+陽性細胞的數量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發現明顯區別。以上結果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發育和數量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發現npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構建斑馬魚Npsn過表達的轉基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發現Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發現明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發現Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關系，以及對研發新的抗菌藥物具有重要的指導意義。

動物模型的制備和應用實驗必須在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監督管理、處置措施、對環境和生態影響等應符合國家相關法律規定。

1．中性粒細胞的形態及生化特征

原始中性粒細胞的發育首先由髓系祖細胞經譜系決定，發育成粒細胞前體細胞，再由粒細胞前體細胞經過增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細胞。在斑馬魚中，區分中性粒細胞可通過以下形態學與細胞學方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細胞最顯著的形態學特征為含有分葉核以及大量顆粒的細胞質，可以在循環系統以及結締組織中被很清晰地辨認。（2）還可以通過分子標記來分辨不同成熟時期的中性粒細胞。已經有研究報道的粒細胞特異分子標記有轉錄因子C/ebp1，粒細胞顆粒中含有的髓過氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過檢測細胞的激活、趨化、變形運動能力、及吞噬、殺菌作用來辨別。（4）此外中性粒細胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據染色程度來辨別不同分化過程的中性粒細胞。

2．中性粒細胞與病原菌感染

中性粒細胞是一種具有多形核的白細胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機體抵抗病原菌感染時起著重要的作用。中性粒細胞在體內含量豐富，大約占人體白細胞總數的40%-75%[3]，并且在機體遭受病原菌感染時，中性粒細胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當中性粒細胞到達感染處后，主要通過兩種方式來抵抗感染，一種是分泌大量的細胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞到達感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴于斑馬魚中性粒細胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細胞內含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱初級顆粒，在早幼粒細胞中數量最多，顆粒中含有髓過氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱次級顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過兩種方式來殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通過激活膜結合成分NADPH系統，產生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過氧非依賴性方式來消化破壞病原菌的細胞膜或壁結構的完整性[10,11]，從而通過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對這些顆粒酶的研究大多數是在體外實驗進行的，大部分顆粒酶的體內功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細胞中所含的顆粒酶種類，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚Npsn蛋白的簡介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發現，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質消化、個體背腹軸確定以及形態發生中起著重要的作用[14]。研究者通過對比鯉魚的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發現Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的孵化液中檢測到Npsn的存在，所以作者猜測Npsn可能沒有孵化酶的活性。而關于Npsn的另一個研究是在斑馬魚中進行的，作者通過分析斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實驗，發現了三個新的特異性表達在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個[15]。并且作者通過雙色原位雜交進一步發現Npsn可能表達在斑馬魚的中性粒細胞中。根據以上前人的研究，我們猜測，Npsn可能是斑馬魚中性粒細胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作為研究中性粒細胞顆粒酶功能的模式生物中的優越性

近幾十年來，斑馬魚逐漸成為一種強大的工具來研究感染類疾病，除了斑馬魚的傳統優勢外，在研究中性粒細胞和病原菌的相互關系中具有獨特的優勢。首先，斑馬魚中性粒細胞的發育過程是保守的，都是起源于造血干細胞，通過早幼粒、中幼粒最終發育成為成熟的帶有分頁核的粒細胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的轉基因技術可以用熒光蛋白標記中性粒細胞，進而在活體實時觀察中性粒細胞對病原菌的響應以及吞噬病原菌的過程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發育過程。

參考文獻

[1] Le Guyader D,Redd MJ, Colucci-Guyon E, et al. Origins and unconventional behavior ofneutrophils in developing zebrafish[J]. Blood, 2008,111(1):132-41.

[2] Jin H, Li L, Xu J,et al. Runx1 regulates embryonic myeloid fate choice in zebrafish through anegative feedback loop inhibiting Pu.1 expression[J]. Blood,2012,119(22):5239-49.

[3] Witko-Sarsat V,Rieu P, Descamps-Latscha B, et al. Neutrophils: molecules, functions andpathophysiological aspects[J]. Lab Invest, 2000,80(5):617-53.

[4] Amulic B, CazaletC, Hayes GL, et al. Neutrophil function: from mechanisms to disease[J]. AnnuRev Immunol, 2012,30:459-89.

[5] Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease[J]. Blood, 1996,87(6):2095-147.

[6] Wawrocki S,Druszczynska M, Kowalewicz-Kulbat M, et al. Interleukin 18 (IL-18) as a targetfor immune intervention[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(1):59-63.

[7] Stephan A,Batinica M, Steiger J, et al. LL37:DNA complexes provide antimicrobial activityagainst intracellular bacteria in human macrophages[J]. Immunology,2016,148(4):420-32.

[8] Faurschou M,Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation[J].Microbes Infect, 2003,5(14):1317-27.

[9] Dinauer MC,Lekstrom-Himes JA, Dale DC. Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis andNew Therapies[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2000:303-18.

[10] Spitznagel JK,Shafer WM. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: ahistorical summary[J]. Rev Infect Dis, 1985,7(3):398-403.

[11] Shafer WM, KatzifS, Bowers S, et al. Tailoring an antibacterial peptide of human lysosomalcathepsin G to enhance its broad-spectrum action against antibiotic-resistantbacterial pathogens[J]. Curr Pharm Des, 2002,8(9):695-702.

[12] Borregaard N.Neutrophils, from marrow to microbes[J]. Immunity, 2010,33(5):657-70.

[13] Hung CH, Huang HR,Huang CJ, et al. Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zincendopeptidase of the astacin family[J]. J Biol Chem, 1997,272(21):13772-8.

[14] Sterchi EE,Stocker W, Bond JS. Meprins, membrane-bound and secreted astacinmetalloproteinases[J]. Mol Aspects Med, 2008,29(5):309-28.

[15] Song HD, Sun XJ,Deng M, et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidneymarrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16240-5.

[16] Tobin DM, May RC,Wheeler RT. Zebrafish: a see-through host and a fluorescent toolbox to probehost-pathogen interaction[J]. PLoS Pathog, 2012,8(1):e1002349.