造血干細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)和鑒定的干細(xì)胞，是研究干細(xì)胞生物學(xué)功能及其調(diào)節(jié)的范式。也是研究各種疾病病理生理機(jī)制及預(yù)防治療措施的重要模型。競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植模型在造血干細(xì)胞功能研究及骨髓移植相關(guān)問(wèn)題研究中應(yīng)用廣泛。

移植過(guò)程中，應(yīng)注意一些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。移植前受體小鼠的清髓一般選擇致死劑量照射，C57BL/6J背景小鼠一般照射總劑量為9.0 Gy，可分2次照射，每次照射劑量為4.5 Gy，中間間隔2 h。照射后2 h 左右進(jìn)行群體細(xì)胞注射，其移植成功效率更高。一般選擇2.5 × 105受體同源的全骨髓細(xì)胞作為保護(hù)細(xì)胞，保護(hù)細(xì)胞數(shù)量過(guò)多會(huì)降低供體來(lái)源細(xì)胞的檢出效率，過(guò)少則無(wú)法保證致死劑量照射小鼠短期的存活。

在制備模型過(guò)程中，使用的輻照儀是自屏蔽的。使用時(shí)有自動(dòng)安全保護(hù)設(shè)置，周?chē)h(huán)境是安全的。

在骨髓移植后1個(gè)月、3個(gè)月分別采血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析外周血中供體細(xì)胞嵌合率：在EP管中加入抗凝劑0.1M EDTA 10ul，從眼后靜脈叢取血30ul，標(biāo)記抗體，使用staining medium調(diào)整染色體積50ul，冰上孵育30min。（4色以上，同時(shí)配備單一抗體染色對(duì)照管）。每管加入1ml BD Pharm Lyse裂解紅細(xì)胞，室溫孵育5-10min，1500rpm/min 離心5min。棄上清，加入1ml staining medium洗一遍；200ul重懸，上機(jī)檢測(cè)不同分型造血免疫細(xì)胞中45.1和45.2細(xì)胞的比例。

模型評(píng)價(jià)方法：在移植后1個(gè)月、2個(gè)月（或者3個(gè)月）采集外周血，流式方法檢測(cè)供體造血細(xì)胞的嵌合率。1個(gè)月時(shí)嵌合率在70~80%；2~3個(gè)月時(shí)嵌合率是40~50%。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性 C57BL/6J-Ly-5.1 (Ly5.1) 小鼠購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究所（PUMC，北京，中國(guó)）；C57BL/6J J（Ly5.2）小鼠購(gòu)自Vital River（中國(guó)北京）。小鼠 8-12 周齡，體重 20-25 克。

2.試劑流式檢測(cè)用抗體均是eBioscience產(chǎn)品。

3.動(dòng)物模型建立方法

3.1移植前準(zhǔn)備：小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，墊料高溫消毒，隔日更換，飼料經(jīng)60Co照射滅菌，飲水為過(guò)濾的無(wú)菌水；

3.2全身照射：C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠在接受骨髓移植前接受致死劑量的放射線照射。采用X或γ射線做全身照射，劑量率0.5-1Gy/min，總劑量9Gy（亦可分兩次照射，每次劑量4.5Gy，間隔時(shí)間2~5小時(shí)，以減少放射線對(duì)器官的損傷）；

3.3供體小鼠骨髓細(xì)胞的分離：從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠骨骼中沖出骨髓有核細(xì)胞作為供體細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×107個(gè)/ml；

3.4制備植入細(xì)胞混合液：將從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠中收集的細(xì)胞與同樣方法收集的C57BL/6J-Ly-5.2小鼠按1：1混合；

3.5移植：將制備的植入細(xì)胞混合液通過(guò)眼后靜脈叢或尾靜脈注射注入全身照射處理后的C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠，每只受體小鼠接受注射液體總量控制在200-300μl。含單個(gè)核骨髓細(xì)胞約1×106個(gè)；

3.6移植后受體給予抗生素一周。飲水中添加乳酸左氧氟沙星0.5mg/ml，建議藥物使用注射液劑型，以避免藥物阻塞飲水口。移植后注意飲食飲水補(bǔ)給，以提高移植成活率。

1、造模因素信息

本模型受體小鼠須接受致死劑量電離輻射。

電離輻射是指攜帶足以使物質(zhì)原子或分子中的電子成為自由態(tài)，從而使這些原子或分子發(fā)生電離現(xiàn)象的能量的輻射。電離輻射的特點(diǎn)是波長(zhǎng)短、頻率高、能量高。電離輻射可以從原子、分子或其他束縛狀態(tài)中放出（ionize）一個(gè)或幾個(gè)電子。電離輻射是一切能引起物質(zhì)電離的輻射的總稱，其種類很多，高速帶電有α粒子、β粒子、質(zhì)子，不帶電粒子有中子以及X射線、γ射線。本實(shí)驗(yàn)中使用的小動(dòng)物專用的X射線、γ射線照射設(shè)備。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6J小鼠，攜帶CD45.1和CD45.2等位基因。分別作為供體小鼠和受體小鼠。

3、研究背景

1961年加拿大科學(xué)家James Till和ErnestMcCulloch在為收到射線照射后小鼠輸注骨髓細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)了小鼠脾結(jié)節(jié)，提出了造血干細(xì)胞的基本特征，奠定了造血干細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)。此后各國(guó)科學(xué)家為分離純化造血干細(xì)胞以及檢測(cè)造血干細(xì)胞功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，研究造血干細(xì)胞移植相關(guān)臨床問(wèn)題進(jìn)行了廣泛的研究。骨髓移植實(shí)驗(yàn)成為檢測(cè)造血干細(xì)胞自我更新和分化的能力的金標(biāo)準(zhǔn)。攜帶CD45.1和CD45.2等位基因的C57BL/6J小鼠培育成功為廣泛應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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