給予動(dòng)物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測(cè)，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著性延長(zhǎng)，避暗錯(cuò)誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對(duì)于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長(zhǎng)20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過(guò)不同的刺激因子對(duì)老鼠造成慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激模型，通過(guò)水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對(duì)于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過(guò)除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無(wú)異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藥品與試劑：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多巴胺（DA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）來(lái)自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美國(guó)莫州）。 （2）儀器： ① 行為學(xué)檢測(cè)：水迷宮儀器 ② 機(jī)制檢測(cè)：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 評(píng)價(jià)方法 （1） 行為學(xué)評(píng)價(jià): ① 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宮計(jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)進(jìn)行。大鼠水迷宮為直徑180cm，高60cm 圓形的水池。在水池壁上標(biāo)明4 個(gè)點(diǎn)，并據(jù)此將水池分為四個(gè)象限，于其中一象限中心置一直徑為10cm，高30cm 的鐵質(zhì)圓形平臺(tái)，水面高于平臺(tái)1cm，水溫控制在(25±2)℃。水迷宮測(cè)試分為兩個(gè)階段，即①定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 天，每只動(dòng)物每天3 個(gè)象限（實(shí)臺(tái)象限除外），將大鼠面向池壁放入水中，記錄1.5 min 內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間(尋臺(tái)潛伏期)。若大鼠入水后1.5 min 內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)上并停留30s，尋臺(tái)潛伏期記錄為1.5 min。② 空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，將大鼠面向水壁從對(duì)角象限入水放入池內(nèi)，記錄1.5 min 內(nèi)，動(dòng)物在實(shí)臺(tái)象限的游程、時(shí)間等指標(biāo)。

② 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

避暗實(shí)驗(yàn)前一天，將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門(mén)自明室放入，任其在明暗室內(nèi)自由活動(dòng)以熟悉環(huán)境。5 min 后，取出，放回原籠。實(shí)驗(yàn)分為記憶獲得和鞏固兩個(gè)階段，均于給藥1 小時(shí)后開(kāi)始檢測(cè)。記憶獲得階段：將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門(mén)自暗室放入，暗室電壓幅度為39v。檢測(cè)時(shí)間為5 min。軟件自動(dòng)記錄5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)、暗室時(shí)間及暗室路程。24 小時(shí)后，進(jìn)行記憶鞏固實(shí)驗(yàn)：將動(dòng)物頭部背向電動(dòng)門(mén)自明室放入，即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，電壓幅度為39 v。軟件自動(dòng)記錄5 min 內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)、入暗潛伏期、暗室時(shí)間及暗室路程。

③皮毛狀態(tài)測(cè)試

皮毛狀態(tài)測(cè)試在實(shí)驗(yàn)前及應(yīng)激刺激結(jié)束后各測(cè)試一次。皮毛狀態(tài)測(cè)試部位包括頭、頸、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七個(gè)部位。皮毛整潔，計(jì)0分，皮毛臟亂，計(jì)1分。皮毛狀態(tài)指數(shù)=計(jì)分總數(shù)/部位數(shù)。

2 機(jī)制的檢測(cè)

①CUMS對(duì)大鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

采用實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)方法-LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：色譜柱為 TSK-GEL Amide-80，柱溫35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）為流動(dòng)相，0.2 mL/min 流速。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源；正離子模式檢測(cè)；電噴霧電壓為4500V；信號(hào)采集方式為多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的儲(chǔ)備液（-80℃保存），臨用前分別吸取各神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋混勻，然后分別稀釋至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋后每200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入300 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL。標(biāo)準(zhǔn)溶液均在臨用前配制。

測(cè)定方法：組織稱重，向EP 管中加入200 μl 純水。用超聲破碎儀進(jìn)行勻漿，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。次日從冰箱內(nèi)取出樣品，在4℃離心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加內(nèi)標(biāo)20μL(300μg/mL DHBA)，將樣品50μl 注入LC-MS/MS 進(jìn)行分析。

②CUMS對(duì)小鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

方法同大鼠。

統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 進(jìn)行組內(nèi)比較，使用最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較方法比較兩組間差異，當(dāng)P <0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. 結(jié)果

（1）CUMS對(duì)大鼠的影響

① CUMS對(duì)大鼠體重的影響

CUMS 模型組大鼠在應(yīng)激發(fā)生第2、3、4、5 周后體重較正常組明顯下降（P<0.01）。西酞普蘭組未能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激因素導(dǎo)致的體重下降。

② CUMS對(duì)大鼠水迷宮的影響

前5天的定位航行中，CUMS大鼠從第二天起尋臺(tái)潛伏期比正常大鼠長(zhǎng)（P<0.05）。在第六天的空間探索實(shí)驗(yàn)中CUMS大鼠與正常大鼠相比，跨平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少（P<0.05）。

（2）CUMS對(duì)小鼠的影響

①CUMS對(duì)小鼠體重的影響

隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，CUMS模型組體重增加緩慢，第5周時(shí)，模型組體重明顯下降，與正常組相比，具有顯著性差異。

③ CUMS對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

結(jié)果顯示，避暗實(shí)驗(yàn)記憶鞏固階段，CUMS模型小鼠入暗次數(shù)及在暗室中的時(shí)間和路程均明顯增加，與正常組相比，具有顯著性差異（P<0.01）。圖3 CUMS模型對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，與正常組比較） （3）機(jī)制檢測(cè)結(jié)果 ① CUMS對(duì)大鼠前額皮層組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響

CUMS 模型組前額皮層5-HT含量較正常組明顯下降（P<0.01），模型組前額皮層NE含量較正常組明顯下降（P<0.05）

1 動(dòng)物：雄性Wistar 大鼠，180-220 g，SPF 級(jí)。分為空白對(duì)照組、CUMS模型組，每組10只。 雄性 BALB/c 小鼠，26-28 g，SPF 級(jí)，分為空白對(duì)照組、CUMS模型組，每組12只。

2 模型誘導(dǎo)方法：

（1）大鼠慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激模型的建立

在本課題組前期CUMS應(yīng)激方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。除正常對(duì)照組外，其余大鼠每日隨機(jī)接受各種不同的應(yīng)激源的刺激，包括：應(yīng)激因素包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、強(qiáng)迫游泳（25℃，20 min 或10 ℃，5 min）、噪聲3 小時(shí)、行為限制（使用自行研發(fā)的大鼠行為限制器，長(zhǎng)20cm, 直徑7 cm），配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。應(yīng)激時(shí)間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。末次給藥后進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)檢測(cè)，并取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。模型組單籠飼養(yǎng)，正常組大鼠群養(yǎng)，每籠5 只，并放置另外房間飼養(yǎng)。

（2）小鼠慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激模型的建立

應(yīng)激因素包括：禁食、禁水、強(qiáng)迫游泳，配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠、晝夜顛倒等。應(yīng)激時(shí)間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。具體刺激時(shí)間同大鼠（表1）

Katz[1]等在20世紀(jì)80年代早期開(kāi)始慢性應(yīng)激模型的研究，連續(xù)三周給予動(dòng)物一系列高強(qiáng)度刺激因素如電擊、冰水游泳等，動(dòng)物呈現(xiàn)抑郁狀態(tài)。Willner[2]等在此基礎(chǔ)上，降低了應(yīng)激刺激的強(qiáng)度，延長(zhǎng)應(yīng)激時(shí)間，并將快感缺失測(cè)試作為該模型的主要評(píng)價(jià)方法，形成了慢性不可預(yù)測(cè)性溫和應(yīng)激模型（CUMS）。應(yīng)激因子包括晝夜節(jié)律的調(diào)整和光照性質(zhì)的改變( 閃光、間斷光照)、食物和飲水的調(diào)整、環(huán)境的改變( 鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊足底、游泳等。應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)測(cè)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。研究發(fā)現(xiàn)，CUMS能夠造成小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙[3]。

因此，本研究聚焦于CUMS對(duì)老鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，采用Morris 水迷宮檢測(cè)慢性應(yīng)激對(duì)大鼠依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；采用避暗行為學(xué)檢測(cè)慢性應(yīng)激對(duì)小鼠記憶的獲得、鞏固、再現(xiàn)等過(guò)程。慢性應(yīng)激對(duì)于Morris 水迷宮的影響，研究報(bào)道不盡一致。有研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能[4]。有報(bào)道認(rèn)為，慢性應(yīng)激可促進(jìn)動(dòng)物在Morris 水迷宮測(cè)試中的學(xué)習(xí)記憶功能[5]。本研究采用Morris 水迷宮檢測(cè)慢性應(yīng)激對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。避暗實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物趨暗避明的習(xí)性設(shè)計(jì)，動(dòng)物進(jìn)入暗室即遭足底電擊，反復(fù)數(shù)次后形成條件反射[6]。這種厭惡性條件反射形成快且恐懼記憶持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是較為敏感的學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)方法。本研究利用避暗實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CUMS 小鼠模型的認(rèn)知功能損傷。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的CUMS刺激因子刺激因子的多變性、不可預(yù)見(jiàn)性是模型成功的關(guān)鍵，單獨(dú)使用一種刺激不能產(chǎn)生理想的效果，每種刺激因子應(yīng)間隔3～7 d[7]，大部分CUMS造模過(guò)程都選擇了7-11種刺激因子，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)選擇了≥12或≤6種的刺激因子，最少的用了4種，最多的用了14種。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最為常見(jiàn)。本模型選用適宜的造模時(shí)間-35天，以及常用的幾種刺激因子，確定該模型誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型為現(xiàn)代人類長(zhǎng)期處于慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激作用下誘發(fā)的學(xué)習(xí)記憶減退機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] KATZ R.Animal model of depression: pharmacological sensitivity of a hedonic deficit[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1982, 16(6): 965-8.

[2] WILLNER P.Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model ofdepression: a 10-year review and evaluation [J]. Psychopharmacology (Berl),1997, 134(4): 319-29.

[3] 瞿禮萍, 曾南, 梁珂, 等. 逍遙散對(duì)慢性溫和應(yīng)激模型小鼠行為學(xué)及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2007,23(5):18-21.

[4] CUADRADO-TEJEDOR M, RICOBARAZA A,DEL RIO J, et al. Chronic mild stress in mice promotes cognitive impairment andCDK5-dependent tau hyperphosphorylation [J]. Behav Brain Res, 2011, 220(2): 338-43.

[5] GOUIRAND A M, MATUSZEWICH L. Theeffects of chronic unpredictable stress on male rats in the water maze [J].Physiology & Behavior, 2005, 86(1-2): 21-31.

[6] SHULZ D,CHERNICHOVSKY D, ALLWEIS C. A novel method for quantifying passive-avoidance behaviorbased on the exponential distribution of step-through latencies [J]. PharmacolBiochem Behav, 1986, 25(5): 979-83.

[7] Willner P．Chronic mildstress ( CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiologicalconcordance in the effects of CMS[J]. Neuropsychobiology，2005, 52(2) :90-110．