（一）模型評(píng)價(jià)方法：

1. 臨床癥狀觀察：

血清中肝功生化指標(biāo)的兩種轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）是肝損傷的重要標(biāo)志物，GGT的變化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情況，同時(shí)對(duì)于肝臟腫瘤也具有一定的指示作用。這些指標(biāo)可通過(guò)常規(guī)血清檢測(cè)得到數(shù)據(jù)。

2. 病毒載量測(cè)定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清樣本處理：用促凝采血管收集的血樣，室溫放置30min后，3000rpm室溫離心10min，得到上層血清放入離心管中備用；組織樣本處理：檢測(cè)WHV病毒載量主要組織樣本為肝臟，分別在每個(gè)肝葉取約50mg樣本，用生理鹽水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至組織破碎完全。使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需長(zhǎng)期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒載量的測(cè)定：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：DNA樣品制備：待測(cè)樣本：待檢測(cè)的感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的WHV-DNA質(zhì)粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl進(jìn)行稀釋；空白對(duì)照：分子級(jí)無(wú)菌蒸餾水 (無(wú)RNA酶和DNA酶)；陰性對(duì)照：未感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清；

實(shí)驗(yàn)步驟：（a）每個(gè)待檢測(cè)樣本反應(yīng)液的組成為：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）擴(kuò)增條件設(shè)定：

（3）儀器檢測(cè)通道選擇：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測(cè)儀時(shí)選擇SYBR Green熒光信號(hào)，收集設(shè)在58℃。具體設(shè)置方法請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)。

（4）結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析，基線和閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

（5） 熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

a. 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下條件，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。

陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增，為陰性。

標(biāo)準(zhǔn)品：CT值＜28

否則結(jié)果無(wú)效。

b. 結(jié)果判斷：

陰性：無(wú)CT值或CT值大于38

陽(yáng)性：CT值＜38，可報(bào)告為陽(yáng)性。

CT值大于38的樣本建議重做，若重做結(jié)果CT值＜38，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

陽(yáng)性樣本具體載量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

圖5. 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

3. 病理分析：HE染色

組織樣本經(jīng)固定、包埋、切片處理后，可通過(guò)H&E染色觀察感染動(dòng)物組織內(nèi)的損傷情況和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)狀況。具體步驟如下：

用10%福爾馬林固定72h，在24h內(nèi)可換液一次；將固定的組織修塊后脫水、透蠟用石蠟包埋；隨后石蠟塊進(jìn)行切片；石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行蘇木精染色；切片繼續(xù)脫水后染伊紅；最后進(jìn)行透明、封片，得到HE病理切片，可進(jìn)行鏡檢。標(biāo)本切片可長(zhǎng)期保存。

（二）評(píng)價(jià)指標(biāo)：

1. 臨床癥狀評(píng)價(jià)：

由于免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全，新生土撥鼠感染W(wǎng)HV病毒后，有60%-70%的概率發(fā)展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指標(biāo)（ALT和AST）都有升高，表現(xiàn)出肝臟損傷；而長(zhǎng)期的病毒復(fù)制導(dǎo)致慢性肝炎，期間雖然血液中檢測(cè)的病毒載量會(huì)有波動(dòng)，但肝部損傷加劇，且肝臟炎癥和腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)升高。

2. 病毒復(fù)制情況評(píng)價(jià)體系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6個(gè)月達(dá)到峰值，平均載量約為107copies/ml。此后由于機(jī)體無(wú)法清除病毒，WHV在肝臟中長(zhǎng)期復(fù)制，在血液中能持續(xù)檢測(cè)到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分時(shí)間維持在104copies/ml。

3. 病理評(píng)價(jià)體系：

WHV病毒感染土撥鼠，在慢性期肝臟病理發(fā)生顯著變化，可觀察到慢性炎癥表型，包括：肝竇擴(kuò)張，大量炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)等。

WHV病毒具有種屬特異性，只感染土撥鼠，不感染人和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；且未出現(xiàn)在《人間傳染的病原微生物名錄》中。動(dòng)物感染病毒和飼養(yǎng)都可在普通環(huán)境中進(jìn)行，但需跟土撥鼠繁殖區(qū)分開(kāi)。WHV病毒已經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。模型實(shí)驗(yàn)已得到IACUC批準(zhǔn)，獲得實(shí)驗(yàn)資質(zhì)。

WHV病毒只對(duì)土撥鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；在土撥鼠種群中常為垂直感染模式，實(shí)驗(yàn)室中采用的為血液感染模式。為預(yù)防對(duì)其他土撥鼠的影響，實(shí)驗(yàn)人員均需經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)獲得證書(shū)，具有生物安全操作資質(zhì)；進(jìn)入動(dòng)物房之前，穿戴防護(hù)服、口罩、帽子、鞋套等進(jìn)行防護(hù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求去除防護(hù)設(shè)備集中處理。盡量避免進(jìn)入感染動(dòng)物區(qū)后再進(jìn)入繁殖區(qū)，若需進(jìn)入則應(yīng)更換整套個(gè)人防護(hù)設(shè)備。

由于感染W(wǎng)HV土撥鼠血液中可能存在著大量病毒，因此對(duì)于采血后的耗材、以及沾染到血液的墊料等，都需要進(jìn)行高壓滅菌處理，以消除正常土撥鼠的潛在感染源。動(dòng)物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-2動(dòng)物房的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)后將病毒毒株、動(dòng)物尸體、尿墊等包裝好進(jìn)行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 動(dòng)物癥狀

所建 HCV 亞復(fù)制子模型為 HCV 基因暫態(tài)表達(dá)模型，未檢測(cè)到對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育和生長(zhǎng)的影響。

2. 模型鑒定

斑馬魚(yú)整體的熒光顯微鏡檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)和原位雜交實(shí)驗(yàn)均檢測(cè)到 HCV RNA多聚酶（NS5B）/基因和 HCV core 蛋白/基因在肝臟的特異性表達(dá)（圖 1A-D）。以 WT型斑馬魚(yú)、單獨(dú)表達(dá) NS5B 和單獨(dú)表達(dá) HCV-core 反義模板的三組斑馬魚(yú)為對(duì)照，采用 RT-PCR 和 Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示 NS5B 和 CORE 的基因和蛋白的共表達(dá)只出現(xiàn)在 HCV 亞復(fù)制子斑馬魚(yú)體內(nèi)（圖 1E，1F），證明所建模型的可信性和有效性。

圖 1. 斑馬魚(yú)肝臟特異性的 HCV 亞復(fù)制子模型A. HCV 亞復(fù)制子基因構(gòu)件示意圖；B. 熒光顯微鏡檢測(cè) HCV-NS5B 基因在斑馬魚(yú)幼體(4 dpf)肝區(qū)特異性表達(dá)，紅色熒光代表 NS5B 蛋白(556 nm excitation, 586 nm emission); C.一條 HCV 亞復(fù)制子幼體分別在白光、藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下的圖像，顯示 HCV 亞復(fù)制子基因組在肝區(qū)的復(fù)制，以綠色熒光代表 HCV-CORE 蛋白的 (480 nm excitation, 505 nm emission)；紅色熒光代表NS5B 蛋白。D. 幼體原位雜交(WISH)結(jié)果，顯示 HCV mini-RNA 基因組在肝區(qū)表達(dá)。標(biāo)尺：150μm。 E.RT-PCR 檢測(cè) HCV core 和 ns5b 基因的表達(dá)；在此只有 HCV mini-genome 被復(fù)制后才能檢測(cè)到 core 基因。F. Western blotting 驗(yàn)證 HCV CORE 和 NS5B 蛋白同時(shí)在 HCV 亞復(fù)制子幼體內(nèi)表達(dá)，而不可同時(shí)出現(xiàn)在其它對(duì)照組。3. 病理改變HCV病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可以導(dǎo)致宿主相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，如HCV效應(yīng)基因：ScarF2、Leugpcr、Rasgbd和Argsyn。我們的檢測(cè)結(jié)果表明，這些基因在HCV亞復(fù)制子幼體內(nèi)的表達(dá)水平均高于野生型斑馬魚(yú)(圖2A)，證明所建HCV亞復(fù)制子模型具有全病毒的一些病理特征。進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR相關(guān)基因，如chop、atf4、atf6和bip基因也均高于野生型斑馬魚(yú)(圖2B)。這些基因均與病毒性肝細(xì)胞炎性病變相關(guān)。

圖 2. RT-PCR 檢測(cè) HCV 感染相關(guān)的宿主基因表達(dá)變化(8 dpf)A. HCV 效應(yīng)基因 ScarF2、Leugpcr、Rasgbd 和 Argsyn 的轉(zhuǎn)錄水平；B. UPR 標(biāo)志基因 chop、atf4、atf6 和 bip 的轉(zhuǎn)錄水平。*p < 0.05; **p < 0.001。

1. HCV 亞復(fù)制子基因載體

HCV 亞復(fù)制子基因載體由兩部分組成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶(NS5B)表達(dá)載體。具體構(gòu)建：克隆小鼠肝臟特異的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并將此序列替換我們前期的 HCV 構(gòu)件的 CMV 啟動(dòng)子，獲得含有 GFP 報(bào)告基因的肝臟特異的 mini-HCV genome。克隆斑馬魚(yú)的肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因的增強(qiáng)子(L-fabpe)和人肝脂酶啟動(dòng)子序列(hLP)，并與 NS5B 編碼序列和報(bào)告基因 RFP 序列重組到真核細(xì)胞表達(dá)載體上，獲得肝臟特異的 NS5B 表達(dá)載體。這兩個(gè)基因構(gòu)件結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖 1A。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚(yú) AB 品系。

3. 造模

取野生型斑馬魚(yú)受精卵（1-4 cell 期），通過(guò)顯微注射將 HCV 亞復(fù)制子的兩個(gè)基2因構(gòu)件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵內(nèi)。正常飼養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至 4 dpf 幼體，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。4. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察 以 WT 斑馬魚(yú)為對(duì)照，觀察斑馬魚(yú)幼體表型和生長(zhǎng)的變化。

（2） 病毒檢測(cè)初篩：熒光顯微鏡下觀察、拍攝幼體內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)分布：在肝臟有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白共表達(dá)的幼體，即為 HCV 亞復(fù)制子模型個(gè)體。確證：采用斑馬魚(yú)整體原位雜交實(shí)驗(yàn)、RT-PCR 和 Western blot 檢測(cè) HCV 亞復(fù)制子的復(fù)制和 HCV 特異的復(fù)制酶 NS5B 的表達(dá)及其肝定位。

Table 1. PCR primers in this study

（3） 病理診斷HCV 基因可導(dǎo)致宿主體內(nèi)病理變化，首先反映在相關(guān)基因表達(dá)的變化。我們采用 RT-PCR 和 Western blot 方法檢測(cè)了 HCV 的效應(yīng)基因如：Solute carrier family 2(ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和 UPR 相關(guān)基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。

一、疾病名稱

丙型肝炎 (Viral hepatitis type C，HC)

二、臨床發(fā)病機(jī)制及癥狀

病毒性肝炎(Viral hepatitis)是由肝炎病毒感染引起的以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、壞死為主要病變的常見(jiàn)傳染病。常見(jiàn)的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚六型。丙型肝炎病毒(HCV)感染者有 70％可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝祝穷净几渭?xì)胞癌的主要人群。HCV是一種(+)鏈 RNA 病毒，特異性侵襲人的肝臟；HCV 在肝臟細(xì)胞內(nèi)的反復(fù)大量復(fù)制、導(dǎo)致宿主細(xì)胞病變、不斷侵染周?chē)８渭?xì)胞，是導(dǎo)致肝炎遷延不愈、促使肝纖維化、肝硬化，直至肝癌的重要誘因。為此，建立一種可模擬 HCV 復(fù)制過(guò)程又可在普通實(shí)驗(yàn)室操作的體內(nèi)模型，可為研究 HCV 復(fù)制機(jī)制與宿主免疫和防御機(jī)制的相互作用提供實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

三、模式動(dòng)物

斑馬魚(yú)(Zebrafish, Danio rerio) AB。